骨髓增生异常综合征患者骨髓TIM3+造血干细胞的研究

【摘要】目的：通过研究骨髓增生异常综合征(MyelodysplasticSyndrome,MDS)患者骨髓T细胞免疫球蛋白粘液素3(T-cellimmunoglobulinandmucin-3,TIM3)阳性造血干细胞数量、生物学特性,及其与骨髓髓源性抑制细胞(Myeloid-derivedsuppressorcells,MDSC)、外周血IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞之间的关系,证实TIM3+干细胞可能是MDS患者骨髓中恶性克隆细胞,且该群细胞与MDSCs扩增,细胞免疫缺陷关系密切。对于TIM3成为鉴别MDS恶性克隆细胞的分子标志物和MDS单克隆抗体治疗的新靶点奠定理论基础。方法：研究对象为天津医科大学总医院自2013年1月至2014年4月初治MDS患者及正常对照。第一部分研究MDS患者骨髓造血干细胞TIM3的表达情况。采用流式细胞术(FCM)检测49例初治MDS患者、22例初治AML患者(阳性对照)及24名正常对照骨髓造血干细胞TIM3的表达情况,并分析MDS患者骨髓TIM3+干细胞数量与血细胞减少程度、骨髓原始细胞比例、MDS分型、核型分析、WPSS积分等临床指标的相关性。第二部分研究37例初治MDS患者TIM3+干细胞生物学特性,采用FCM检测MDS患者骨髓TIM3+干细胞、MDS患者骨髓TIM3-干细胞与24名正常对照组TIM3-干细胞表达分化／增殖抗原(CD11b/CD71)、造血因子受体(TpoR、EpoR和G-CSFR)、转录因子(GATA-1和GATA-2)及凋亡分子(AnnexinV)的表达情况,分别从分化、增殖和凋亡方面评价MDS患者骨髓TIM3+干细胞的恶性生物学特征。第三部分研究MDS患者骨髓TIM3+干细胞数量与骨髓MDSC数量之间的关系。采用FCM检测43例MDS患者及15名正常对照骨髓MDSC(Lin-HLA-DR-CD33+)数量,并分析TIM3+干细胞数量与MDSC数量之间的相关性。第四部分研究MDS患者骨髓TIM3+干细胞数量与外周血IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞之间的关系。体外活化淋巴细胞,FCM检测19例MDS患者和12名性别年龄匹配的正常对照外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞胞内IFN-γ的表达情况,并分析MDS患者TIM3+干细胞与IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞数量之间的相关性。结果：第一部分MDS患者骨髓CD34+CD38-Lin-细胞TIM3表达率明显高于正常对照组(37.81％vs0.63％,P<0.001),与AML组接近(37.81%vs33.15%,P=0.527):MDS患者TIM3+干细胞的平均荧光强度(MFI)明显高于对照组(51.29vs4.69,P<0.001),与AML组接近(51.29vs68.63,P=0.455).对TIM3+干细胞与临床指标进行相关性分析,TIM3+干细胞与血红蛋白水平(r=-0.378,P=0.009)呈显著负相关；与中性粒细胞计数呈显著负相关(r=-0.470,P=0.001)；血细胞减少受累系数越多,TIM3+干细胞数量越多(F=5.912,P=0.005)；与骨髓原始细胞比例呈显著正相关(r=0.364,P=0.014)；在核型分析中,良性核型组(正常、del(5(1)和del(20q)),恶性核型组(复杂核型即大于等于3种核型异常,7号染色体异常)及中间核型组(除以上所述的核型)的TIM3+干细胞比例分别是：良性33.69±24.73%vs恶性61.69±23.53%vs中间40.07±21.96%,三组间比较有显著性差异(F=4.575,P=0.016)；随着WPSS评分的逐渐升高,TIM3+干细胞的数量亦逐渐增多(F=4.176,P=0.002)。第二部分MDS患者骨髓TIM3-干细胞与对照组TIM3-干细胞表达分化、增殖、凋亡相关抗原、造血因子受体及转录因子没有显著性差异,因此可将MDS患者TIM3-干细胞看作是相对正常的造血干细胞。再对MDS患者TIM3+干细胞与TIM3-干细胞进行配对比较：TIM3+干细胞低表达CDllb(17.38±12.56%vs26.76±19.33%,P<0.001).TpoR(17.19±21.15%vs.26.91±26.88%,P<0.001).EpoR(31.88±19.51%Vs.41.68±25.99%,P=0.009).G.CSFR(38.99±24.51%vs.47.30±24.15%,P=0.005):过表达CD71(48.03±22.57%vs.30.81±23.87%,P<0.001)、GATA-2(64.04±22.90%vs.47.20±25.48%,P<0.001).第三部分MDS患者骨髓MDSCs比例明显高于正常对照组(1.79±0.56%vs0.34±0.24%,P=0.014):MDS患者骨髓MDSCs的MFI明显高于正常对照组(47.90±37.37vs8.25±2.17,P<0.001):MDS患者骨髓MDSCs比例与TIM3+干细胞比例呈显著正相关(r=0.556,P<0.001)。第四部分MDS组和正常对照组平均年龄及性别比例没有显著性差异(P>0.05),MDS患者外周血IFN.Y+CD4+T/CD4+T比例明显低于正常对照组(8.93±6.53%vs23.87±8.83%,T=-5.508,P<0.001),IFN-γ+CD4+T细胞数量与骨髓TIM3+干细胞呈显著负相关(r=-0.579,P=0.009)；MDS患者外周血IFN-γ+CD8+T/CD8+T比例明显低于正常对照组(18.28±13.74%vs32.98±9.14%,t=-3.353,P=0.002),IFN-γ+CD8+T细胞数量与骨髓TIM3+干细胞呈显著负相关(r=-0.590,P=0.008)。结论(1),MDS患者骨髓TIM3+干细胞数量明显高于对照组,而与AML患者接近,TIM3+干细胞数量与MDS患者疾病进展及不良预后密切相关；(2)MDS患者骨髓TIM3+干细胞具有分化异常、过度增殖和凋亡减低的恶性生物学特征；(3)MDS患者骨髓MDSC数量增多,并且与TIM3+干细胞数量呈正相关,提示TIM3+干细胞与MDSC的扩增相关;(4)MDS患者外周血IFN-γ+CD4+T细胞、IFN-γ+CD8+T细胞数量较正常对照组明显减少,均与TIM3+干细胞数量呈负相关,提示TIM3+干细胞与细胞免疫功能低下关系密切。(5)TIM3+干细胞可能既是恶性克隆细胞的“根源”,又是造成患者细胞免疫缺陷的“罪魁祸首”,二者互相促进,形成恶性循环,最终导致MDS向AML的转化。
【作者】陶景莲；
【导师】邵宗鸿；
【作者基本信息】天津医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】骨髓增生异常综合征；T细胞免疫球蛋白粘液素3(TIM3)；造血干细胞；髓源性抑制细胞；(MDSC)；IFN-γ+CD4+T细胞；IFN-γ+CD8+T细胞；

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